دانلود پایان نامه درمورد
میزان، میلی، دقیقه پایان نامه ها

بود. سپس به تمام لوله ها 5 میلی لیتر آب مقطر اضافه و به خوبی به هم زده شدند. بعد قرائت نوری با استفاده از اسپکتروفوتومتری در طول موج 540 نانومتر انجام شد. برای رسم منحنی استاندارد در محور X غلظت مالتوز (mol/ml/ ) و در محور Y قرائت نوری قرار گرفته و منحنی مربوطه رسم گردید.

نمودار2-2- منحنی استاندارد مالتوز

ب- تعیین فعالیت آنزیم آلفا- آمیلاز
ابتدا 250 میکرولیتر از عصاره آنزیمی رقیق شده با آب مقطر سرد به لوله آزمایشی و 250 میکرولیتر آب مقطر نیز به لوله دیگری به عنوان شاهد با پیپت وارد شد. سپس عمل انکوباسیون به مدت 3-4 دقیقه در 25 درجه سانتیگراد انجام شد تا به دمای تعادل برسند. سپس 250 میکرولیتر از نشاسته 1 درصد به لوله ها اضافه گردید و عمل انکوباسیون دقیقا به مدت 3 دقیقه انجام شد. بعد از 3 دقیقه 5/0 میلی لیتر از معرف رنگی دی نیترو سالیسیلیک اسید به لوله ها اضافه گردید و به مدت 5 دقیقه لوله ها از حمام خارج شده و در دمای اتاق خنک شدند سپس 5 میلی لیتر آب مقطر به لوله ها اضافه گردید و بعد محتویات لوله ها به خوبی مخلوط شده و قرائت نوری در 540 نانومتر انجام گرفت. سپس قرائت نوری انجام شده در منحنی استاندارد مالتوز قرار گرفته و میزان مالتوز رهاسازی شده تحت اثر آنزیم بر روی سوبسترا (نشاسته) بدست آمد. واحد فعالیت آلفا- آمیلاز،بر حسب میکرو مول مالتوز آزاد شده تحت اثر آنزیم در دقیقه به ازای میلی گرم پروتئین از طریق فرمول زیر محاسبه شد (Worthington، 1991).
فاکتور رقت *
میزان مالتوز آزاد شدmol) µ(
= میزان پروتئین (mg) / فعالیت آنزیمی (U)

مدت زمان انکوباسیون (دقیقه) * میزان پروتئین در نمونه (mg)

4-7-2- سنجش فعالیت آنزیم لیپاز
فعالیت لیپازی با استفاده از هیدرولیز p-nitrophenylemyristate و به طریق اسپکتروفتومتری تعیین گردید.

معرف :
1- محلول سوبسترا
شامل 53/0 میلی مولار از p-nitrophenylemyristate، 25/0 میلی مولار از 2- methoxy ethanol، 5 میلی مولار از sodium cholate و 25/0 مولار Tris- HCl در pH 9 می باشد.
2- محلول n-heptane / acetone
3- برای تهیه این محلول 5 قسمت از استون با 2 قسمت از ان- هپتان با هم مخلوط شدند. این محلول بعلت نقطه تبخیر پایین باید در ظروف درب دار نگهداری شود.
4- روش کار
5- برای هر سنجش لیپازی 5 میکرولیتر از عصاره آنزیمی به 5/0 میلی لیتر محلول سوبسترا اضافه و به مدت 15 دقیقه در دمای 30 درجه سانتیگراد انکوباسیون شدند سپس واکنش با افزودن 7/0 میلی لیتر از محلول (v/v ، 5:2) n- heptane/ acetone متوقف گردید. مخلوط واکنش بعد از هم زدن کامل به مدت 2 دقیقه درg 6080 و در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفوژ شد و میزان جذب لایه ماوی (aquatic) زیرین در 405 نانومتر قرائت گردید (Iijiama، 1998).
6- شاهد نیز مانند نمونه بالا آماده سازی شد با این تفاوت که محلول آنزیمی پس از افزودن محلول (v/v ، 5:2) n- heptane / acetone به لوله آزمایش اضافه شد.

حجم محلول درون کوت (ml) * 1000* (مدت زمان انکوباسیون / ( nm405) میزان جذب)

= میزان پروتئین (mg) / فعالیت آنزیمی (U)
میزان پروتئین در نمونه (mg) * 16500

16500 ضریب ثابت مولکولی یا ضریب تاریکی برای پارا- نیتروفنل است.

5-7-2- سنجش فعالیت آنزیم پروتئاز :
سنجش فعالیت آنزیم پروتئاز با استفتده از محلول سوبسترا آزوکازئین 5/1% در 50 میلی مولار بافر Tris/Hcl در5/7 = pH پذیرفت. 20 میلی لیتر از نمونه عصاره آنزیمی با 5/0 میلی لیتر بافر Tris/Hcl در دمای 25 درجه سانتیگرا مخلوط شد. سپس 5/0 میلی لیتر از محلول TCA (Trichloroacetic acide) می شود که این آغاز واکنش است. پس از 10 دقیقه انکوباسیون در دمای 25 درجه سانتیگراد میکروتیوبها در دستگاه سانتریفیوژ میکروتیوب (اسم دستگاه) به مدت 5 دقیقه با سرعت g × 6500 سانتریفیوژ شدند. و سپس محلول رویی میکروتیوبها را داخل میکرپلت ته صاف ریخته و میزان جذب با دستگاه اسپکتوفتومتری مدل(اسم دستگاه) با طول موج 440 نانومتر قرائت شدند. برای گروه شاهد نیز از آب مقطر استفاده می شد. و در نهایت میزان فعالیت آنزیمی با تعیین میزان جذی نوری در طول موج 440 نانومتر به ازای مدت انکوباسیون (10دقیقه) و میزان پروتئین عصاره آنزیمی (میلیگرم) محاسبه می شود(Garcia-carreno et al,1993) .

8-2- بررسیهای ایمنی شناسی
در پایان دوره 9 ماهی از هر تیمار به طور تصادفی انتخاب شده و پس از بیهوشی در محلول پودر گل میخک اقدام به خونگیری شده نمونه خون وریدی اخذ شد و سپس سرم نمونه خون جدا شده و تست لیزوزیم و فعالیت راه میانبر سیستم کمپلمان مورد ارزیابی قرار گرفت.

1-8-2- خون گیری و تهیه سرم
پس از بیهوشی ماهیان، خونگیری در شرایط استریل از ورید ساقه دمی با استفاده از سرنگ یکبار مصرف با سر سوزن سایز 22 صورت گرفت. پس از خون گیری، خون به یک لوله استریل منتقل و اجازه داده شد به مدت یک ساعت در دمای اتاق منعقد گردد. سپس 5 ساعت دیگر در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری شد. در پایان این مدت برای تهیه سرم نمونهها با دور g× 1500 به مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شدند.
2-8-2- فعالیت راه میانبر سیستم کمپلمان:
فعالیت راه میانبر کمپلمان بر اساس همولیز گلبولهای قرمز خرگوش (RaRBC) و به کمک Boesen وهمکاران (1999) و Amarوهمکاران (2000) اندازه گیری شد. به طور خلاصه، گلبولهای قرمز خرگوش سه مرتبه با بافر اتیلن گلیکول تترا استیک اسید- منیزیوم- ژلاتین ورونال (10/0 مولار، 7=pH، شسته شده و تعداد سلولهای آن به کمک لام نئوبار در هر میلی لیتر بافر cell/ml 108 × 2 تنظیم شد. ابتدا دانسیته نوری14 لیز درصد گلبولهای قرمز خرگوش با افزودن 100 میکرولیتر از سوسپانسیون فوق
به 4/3 میلی لیتر آب مقطر تعیین گردید. برای اینکار مخلوط فوق با دور g×1600 به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شده و دانسیته نوری محلول رویی در طول موج 414 نانومتر به کمک دستگاه اسپکتروفتومتر محاسبه شد. سپس نمونههای سرم ابتدا 100 مرتبه با بافر فوق رقیق شدند. حجمهای متفاوتی از آن در هفت لوله آزمایش استریل تهیه شده و حجم همه لولهها به کمک بافر به 250 میکرولیتر رسانده شد. سرانجام به همه لولهها 100 میکرولیتر گلبول قرمز خرگوش اضافه گردید. مخلوط فوق به مدّت 90 دقیقه در دمای 20 درجه سانتیگراد انکوبه شد. در این مدت به طور متناوب هر 15 دقیقه یکبار لولهها تکان داده شدند. در پایان به هر کدام از لولهها ml 15/3 محلول 87/0 درصد کلرید سدیم اضافه شد. سپس لولهها با دور g×1600 به مدت 10 دقیقه و دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شده و دانسیته نوری محلول رویی با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 414 نانومتر محاسبه شد. برا ی محاسبه میزان فعالیت راه میانبر سیستم کمپلمان با استفاده از کاغذ شطرنجی15 منحنی لیز رسم شد. طبق تعریف حجمی از سرم که سبب 50 درصد همولیز شود عبارتست از فعالیت کمپلمان نمونه و از رابطه زیر محاسبه شد:
5/0 × (فاکتور رقت) × K = (U/ml) ACH505
در رابطه فوق K مقداری از سرم بر حسب ml است که موجب 50 درصد همولیز میشود. 5/0 عدد ثابت بوده و فاکتور رقت در این تست 01/0 میباشد چون سرم 1:100رقیق شده است.

این مطلب رو هم توصیه می کنم بخونین:   منابع مقاله با موضوعبارندگی، میانگین، ایستگاه

نحوه تهیه بافرها
* بافر PBS
جدول 5-2- ترکیب بافر PBS
مولاریته (میلی مول)
مقدار(g/l)
نام ماده
7/2
2/0
KCL
5/1
2/0
KH2PO4
9/136
8
Nacl
1/8
2/2
Na2HPO42H2O
20
21/5
HEPES بدون نمک

* بافر اتیلن گلیکول تترا استیک اسید-منیزیوم-ژلاتین ورونال
محلول A: 804/3 گرم اتیلن گلیکول تترا استیک اسید (EGTA) به همراه 72/0 گرم هیدروکسید سدیم (NaOH) به 250 میلی لیتر آب دیونیزه16 افزوده شده و پس از تنظیم pH روی 5/7 حجم محلول به 500 میلی لیتر رسانده میشود.
محلول B: حل کردن 2033/0 گرم MgCl2.6H2O در 100 میلی لیتر آب دیونیزه (مولاریته، 10 میلی مول).
محلول C: در یک ظرف جداگانه مقدار 1/0 گرم ژلاتین را در 100 میلی لیتر آب دیونیزه داغ حل شود. سپس 88/4 گرم کلرید سدیم به همراه 9/0 گرم باربیتورات سدیم17 و 64/0 اسید کلریدریک در ظرف دیگری ریخته و حجم نهایی به یک لیتر رسانده شود. جهت آماده کردن محلول C، 10 میلی لیتر از محلول ژلاتین با 200 میلی لیتر محلول قبلی مخلوط شده و حجم نهایی به یک لیتر رسانده میشود. این محلول به مدت 48 ساعت در دمای 4-2 درجه سانتی گراد قابل نگهداری است.
محلول D: مقدار 25 گرم D- گلوکز در 500 میلی لیتر آب دیونیزه حل گردد.

محلول کاری بافر:
محلول A
محلول B
محلول C
محلول ِD
50 میلی لیتر
35 میلی لیتر
104 میلی لیتر
311 میلی لیتر
سپس pH محلول روی 6/7-4/7 تنظیم گردد. ( Waley and North, 1997).

3-8-2- فعالیت لیزوزیم:
فعالیت لیزوزیم سرم بر اساس روشClerton و همکاران (2001) ، Kim وAustin (2006) و بر مبنای لیز باکتری گرم مثبت حساس به آنزیم لیزوزیم یعنی میکروکوکوس لیزودیکتکوس18 (Sigma, M 3770, St. Louis, USA) اندازه گیری شد. به طور خلاصه، سرم مورد آزمایش چهار مرتبه با استفاده از بافر سیترات – فسفات (1/0 مولار، pH=5/8) و ضریب رقّت یک دوم رقیق شده و 100 میکرولیتر از رقّتهای سرم در چاهکهای میکروپلیت 96 خانهای (ته صاف) ریخته شد. سپس به هر کدام از چاهکها 100 میکرولیتر از سوسپانسیون تهیه شده باکتری در همان بافر (µg/ml75) افزوده شده و بلافاصله نمونهها مخلوط شدند. سپس اجازه داده شد این واکنش در دمای 25 درجه سانتیگراد صورت گیرد. در نهایت جذب نوری19 نمونهها هر 30 ثانیه یکبار تا 5/4 دقیقه به کمک الایزا ریدر در طول موج 530 نانومتر قرائت شد و از بافر سیترات – فسفات به عنوان بلانک استفاده شد. همچنین برای کنترل منفی از بافر فوق به جای سرم استفاده گردید. در نهایت طبق تعریف یک واحد فعالیت لیزوزیم عبارت خواهد بود از مقدار سرمی که سبب کاهش جذب نوری به مقدار 001/0 در دقیقه شود.
طرز تهیه بافر سیترات فسفات
ابتدا محلول ذخیره (استوک) فسفات (1/0 مولار) با افزودن 903/8 گرم NaHPO4.2H2O به 500 میلی لیتر آب مقطر تهیه شده، سپس محلول ذخیره سیترات (1/0 مولار) با افزودن 1014/2 گرم اسید سیتریک در 100 میلی لیتر آب مقطر تهیه میشود. در نهایت برای تهیه 100 میلی لیتر محلول کاری، 70 میلی لیتر از محلول ذخیره فسفات در یک ظرف استریل ریخته آنقدر محلول ذخیره اسید سیتریک به آن اضافه میشود تا pH محلول روی 8/5 تنظیم گردد. سپس به آن 90 میلی گرم NaCl به آن افزوده شده و محلول کاری با استفاده از فیلتر میلی پور استریل میشود. (تکمه چی. ا، 1386).

4-8-2- اندازه گیری میزان توتال ایمونوگلوبولین(Total immunoglobolin)
برای اندازه گیری این فاکتور ایمنی از روش Bradford protein assay استفاده می شود، و اساس کار در این روش بر مبنای میزان جذب نوری است که محلول Coomassie Brilliant Blue G-250 (به عنوان ماده رنگ پذیر) هنگام اتصال با پروتئین های نمونه در طول موج nm 595 نشان می دهد.
خلاصه روش کار به این ترتیب است که مقدار μlitr100 از سرم نمونه را با ml 5 معرف حاوی Coomassie Brilliant Blue G-250 درون تویوپ مخصوص مخلوط کرده و در طول موج nm 595 میزان جذب نوری آن قرائت شده و با استفاده از منحنی استاندارد میزان توتال ایمونوگلوبولین محاسبه می شود.
9-2- بررسی فاکتورهای خونی
در پایان دوره 9 ماهی از هر تیمار به طور تصادفی انتخاب شده و پس از بیهوشی در محلول پودر گل میخک اقدام به خونگیری شده و پس از افزودن ماده ضد انعقاد هپارین به آن جهت
بررسی فاکتورهای خونی نظیر تعداد گلبول های سفید و قرمز در میکرولیتر خون، هماتوکریت و هموگلوبین مورد استفاده قرار می گیرد.

1-9-2- شمارش تعداد گلبول های سفید در میکرولیتر خون
برای شمارش گلبول های سفید ابتدا خون حاوی ماده ضد انعقاد را به نسبت 1 به 200 با محلول نات-هریک (Nott Herick) (20 میکرولیتر خون حاوی هپارین در 4 میلی لیتر محلول نات-هریک) رقیق کرده، سپس حجم آن را با آب مقطر به 1000 میلی لیتر


دیدگاهتان را بنویسید